Das ECS - Entwicklung eines ACTH-Bioassays
21.10.2007, 18:15
Katja Sommer
Das Equine Cushing-Syndrom:
Entwicklung eines ACTH-Bioassays für die Ermittlung
des biologisch-immunreaktiven Verhältnisses
von endogenem ACTH in equinen Blutproben
http://elib.tiho-hannover.de/dissertati ... _2003.html
Das Equine Cushing-Syndrom (ECS) galt lange Zeit als eine selten vorkommende und nur bei alten Pferden und Ponys auftretende Erkrankung. Durch eine Vielzahl an wissenschaftlichen Abhandlungen und neu gewonnenen Erkenntnissen sowie einer verbesserten Aufklärung der Tierärzteschaft wurde das ECS in den letzten Jahren jedoch immer häufiger diagnostiziert. Dabei stellen auch jüngere Pferde (bis 10 Jahre) eine ernstzunehmende Patientengruppe dar.
In der vorliegenden Studie wurde ein ACTH-Bioassay mit porcinen Nebennierenrindenzellen entwickelt, um die biologische Aktivität von endogenem ACTH in equinen Plasmaproben messen zu können. Anschließend wurde das biologisch-immunreaktive ACTH-Verhältnis (ACTH-BI-Ratio) beurteilt. Durch die Ermittlung der ACTH-BI-Ratio soll im Bereich der Diagnostik geklärt werden, warum es trotz hoher ACTH-Basalwerte, wie sie im Plasma an ECS erkrankter Pferde häufig vorkommen, zu keiner adäquaten Cortisol-Sekretion der Nebennierenrindenzellen kommt. Die Cortisolwerte befinden sich dabei überwiegend im Referenzbereich oder sind sogar erniedrigt. Die Stimulation der Nebennierenrindenzellen steht somit nicht im Verhältnis zur endogenen ACTH-Sekretion aus der Pars intermedia der Hypophyse. Des weiteren wurde in dieser Arbeit erläutert, warum sich bei erkrankten Pferden trotz niedriger Cortisol-Basalwerte klinische ECS-Symptome manifestieren.
ACTH-Bioassay mit porcinen Nebennierenrindenzellen
Aufgrund der besseren Zellqualität wurden für die Versuche nur Nebennieren von jungen Schlachtschweinen verwendet. Die Auflösung der Zellverbände erfolgte in einem Gewebszerkleinerer unter Zugabe von Kollagenase und speziellem Kulturmedium. Die Blutproben mußten unbehandelt im Bioassay eingesetzt werden, da sich die Steroidabsorption an Aktivkohle sowie die Steroidextraktion mit Lösungsmitteln für die Entfernung des endogenen Cortisols auf die porcinen Zellen hemmend auswirkten. Jedoch konnten für den Bioassay alle Arten an Blutproben (Serum/Plasma) verwendet werden, da weder Serumbestandteile noch Blutzusätze (EDTA, Lithium-Heparin und Aprotinin) den Ablauf des Assays beeinflußten.
Biologisch-immunreaktives Verhältnis von endogenem ACTH (ACTH-BI-Ratio)
Für die Ermittlung der biologischen Aktivität des endogenen ACTHs wurden jeweils 5 Plasmaproben an ECS erkrankter, bereits therapierter sowie gesunder Pferde im ACTH-Bioassay eingesetzt und deren biologische ACTH-Aktivität als Äquivalent von Synacthen® (ACTH1-24) mit Hilfe der ACTH-Eichkurve berechnet. Anschließend wurde die biologische Aktivität mit der immunreaktiven Aktivität des endogenen ACTHs ins Verhältnis gesetzt.
Sowohl in vitro als auch in vivo kommt es trotz hoher ACTH-Plasmakonzentrationen nur zu einer verhältnismäßig geringen Cortisol-Ausschüttung der Nebennierenrindenzellen. Dies liegt an der unterschiedlichen biologischen und immunreaktiven Aktivität des endogenen ACTHs. Das biologisch-immunreaktive Verhältnis des ACTHs der in dieser Studie untersuchten Plasmaproben lag bei den an ECS erkrankten Pferden zwischen 1:15,3 und 1:84,9, bei den bereits therapierten Pferden zwischen 1:1,4 und 1:21,4 sowie bei den gesunden Pferden zwischen 1,4:1 und 1:3,2. Demzufolge wird von der tumorös entarteten Pars intermedia der Hypophyse wesentlich mehr biologisch inaktives ACTH ausgeschüttet.
Eine weitere mögliche Erklärung wäre, dass beim Pferd auch ACTH-Antagonisten oder Inhibitoren vorhanden sein könnten, die die Aktivität der Nebennierenrinde herabsetzen. In diesem Zusammenhang wurden hohe Insulinlevel und von der tumorös entarteten Pars intermedia vermehrt sezernierte Peptide, wie a -MSH, b -MSH, CLIP, b -END, g 3-MSH, b -LPH und N-terminale Peptide, als mögliche Faktoren angeführt.
Schließlich könnten auch falsch hohe gemessene ACTH-Basalwerte ein möglicher Grund für die Unverhältnismäßigkeit zwischen der ACTH- und Cortisol-Plasmakonzentration sein. Als Ursachen werden die Messung von ACTH-ähnlichen Aminosäure-Sequenzen bei anderen Pro-Opiolipomelanocortin(pro-OLMC-)Peptiden sowie heparinvernetzte ACTH- Molekülaggregationen diskutiert.
Unerklärlicher Weise kam es aber auch bei einem der therapierten Pferde und bei zwei der gesunden Pferde trotz im IMMULITE® niedrig gemessener ACTH-Basalwerte (Referenz) zu einer deutlichen Stimulation der porcinen Zellen. Das biologisch-immunreaktive Verhältnis des endogenen ACTHs lag bei diesen Proben bei 1:1,4, 1:3,1 und 1:2,6. Die Vermutung, dass das endogene ACTH während der Lagerung der Proben eventuell in biologisch aktive Substanzen zerfallen sein könnte, welche zur Stimulation der porcinen Zellen führen, konnte im Rahmen einer Stabilitätsstudie widerlegt werden. Demnach muß in Erwägung gezogen werden, dass der Bioassay mit porcinen Nebennierenrindenzellen für equine Blutproben nicht bedingungslos kompatibel ist. Durch diesen Bioassay lassen sich für die ACTH-stimulierte Cortisol-Ausschüttung der porcinen Zellen lediglich Tendenzen aufzeigen.
Entwicklung der klinischen ECS-Symptomatik
Bei an ECS erkrankten Pferden manifestieren sich trotz physiologischer oder sogar erniedrigter Cortisol-Plasmagehalte klinisch sichtbare ECS-Symptome. Demnach müssen noch andere biologisch aktive Substanzen, wie pro-OLMC-Peptide (a -MSH,
b -MSH, b -END, b -LPH, g -LPH, CLIP und g 3-MSH) oder ACTH-Fragmente, die qualitativ oder quantitativ verändert aus dem tumorösen Hypophysenzwischenlappen freigesetzt werden, an der Entwicklung der klinischen Symptomatik beteiligt sein.
Neben den endokrin bedingten klinischen Symptomen, könnte ein Teil der Symptomatik auch allein durch das Tumorwachstum verursacht werden. Durch die Expansion der Neoplasie wird Druck auf den Hypothalamus ausgeübt, wodurch kapilläre und neurale Verbindungen zwischen Hypothalamus und Hypophyse geschädigt werden und es so zu einer Entgleisung der hypothalamischen Funktionen kommt.
Das Equine Cushing-Syndrom:
Entwicklung eines ACTH-Bioassays für die Ermittlung
des biologisch-immunreaktiven Verhältnisses
von endogenem ACTH in equinen Blutproben
http://elib.tiho-hannover.de/dissertati ... _2003.html
Das Equine Cushing-Syndrom (ECS) galt lange Zeit als eine selten vorkommende und nur bei alten Pferden und Ponys auftretende Erkrankung. Durch eine Vielzahl an wissenschaftlichen Abhandlungen und neu gewonnenen Erkenntnissen sowie einer verbesserten Aufklärung der Tierärzteschaft wurde das ECS in den letzten Jahren jedoch immer häufiger diagnostiziert. Dabei stellen auch jüngere Pferde (bis 10 Jahre) eine ernstzunehmende Patientengruppe dar.
In der vorliegenden Studie wurde ein ACTH-Bioassay mit porcinen Nebennierenrindenzellen entwickelt, um die biologische Aktivität von endogenem ACTH in equinen Plasmaproben messen zu können. Anschließend wurde das biologisch-immunreaktive ACTH-Verhältnis (ACTH-BI-Ratio) beurteilt. Durch die Ermittlung der ACTH-BI-Ratio soll im Bereich der Diagnostik geklärt werden, warum es trotz hoher ACTH-Basalwerte, wie sie im Plasma an ECS erkrankter Pferde häufig vorkommen, zu keiner adäquaten Cortisol-Sekretion der Nebennierenrindenzellen kommt. Die Cortisolwerte befinden sich dabei überwiegend im Referenzbereich oder sind sogar erniedrigt. Die Stimulation der Nebennierenrindenzellen steht somit nicht im Verhältnis zur endogenen ACTH-Sekretion aus der Pars intermedia der Hypophyse. Des weiteren wurde in dieser Arbeit erläutert, warum sich bei erkrankten Pferden trotz niedriger Cortisol-Basalwerte klinische ECS-Symptome manifestieren.
ACTH-Bioassay mit porcinen Nebennierenrindenzellen
Aufgrund der besseren Zellqualität wurden für die Versuche nur Nebennieren von jungen Schlachtschweinen verwendet. Die Auflösung der Zellverbände erfolgte in einem Gewebszerkleinerer unter Zugabe von Kollagenase und speziellem Kulturmedium. Die Blutproben mußten unbehandelt im Bioassay eingesetzt werden, da sich die Steroidabsorption an Aktivkohle sowie die Steroidextraktion mit Lösungsmitteln für die Entfernung des endogenen Cortisols auf die porcinen Zellen hemmend auswirkten. Jedoch konnten für den Bioassay alle Arten an Blutproben (Serum/Plasma) verwendet werden, da weder Serumbestandteile noch Blutzusätze (EDTA, Lithium-Heparin und Aprotinin) den Ablauf des Assays beeinflußten.
Biologisch-immunreaktives Verhältnis von endogenem ACTH (ACTH-BI-Ratio)
Für die Ermittlung der biologischen Aktivität des endogenen ACTHs wurden jeweils 5 Plasmaproben an ECS erkrankter, bereits therapierter sowie gesunder Pferde im ACTH-Bioassay eingesetzt und deren biologische ACTH-Aktivität als Äquivalent von Synacthen® (ACTH1-24) mit Hilfe der ACTH-Eichkurve berechnet. Anschließend wurde die biologische Aktivität mit der immunreaktiven Aktivität des endogenen ACTHs ins Verhältnis gesetzt.
Sowohl in vitro als auch in vivo kommt es trotz hoher ACTH-Plasmakonzentrationen nur zu einer verhältnismäßig geringen Cortisol-Ausschüttung der Nebennierenrindenzellen. Dies liegt an der unterschiedlichen biologischen und immunreaktiven Aktivität des endogenen ACTHs. Das biologisch-immunreaktive Verhältnis des ACTHs der in dieser Studie untersuchten Plasmaproben lag bei den an ECS erkrankten Pferden zwischen 1:15,3 und 1:84,9, bei den bereits therapierten Pferden zwischen 1:1,4 und 1:21,4 sowie bei den gesunden Pferden zwischen 1,4:1 und 1:3,2. Demzufolge wird von der tumorös entarteten Pars intermedia der Hypophyse wesentlich mehr biologisch inaktives ACTH ausgeschüttet.
Eine weitere mögliche Erklärung wäre, dass beim Pferd auch ACTH-Antagonisten oder Inhibitoren vorhanden sein könnten, die die Aktivität der Nebennierenrinde herabsetzen. In diesem Zusammenhang wurden hohe Insulinlevel und von der tumorös entarteten Pars intermedia vermehrt sezernierte Peptide, wie a -MSH, b -MSH, CLIP, b -END, g 3-MSH, b -LPH und N-terminale Peptide, als mögliche Faktoren angeführt.
Schließlich könnten auch falsch hohe gemessene ACTH-Basalwerte ein möglicher Grund für die Unverhältnismäßigkeit zwischen der ACTH- und Cortisol-Plasmakonzentration sein. Als Ursachen werden die Messung von ACTH-ähnlichen Aminosäure-Sequenzen bei anderen Pro-Opiolipomelanocortin(pro-OLMC-)Peptiden sowie heparinvernetzte ACTH- Molekülaggregationen diskutiert.
Unerklärlicher Weise kam es aber auch bei einem der therapierten Pferde und bei zwei der gesunden Pferde trotz im IMMULITE® niedrig gemessener ACTH-Basalwerte (Referenz) zu einer deutlichen Stimulation der porcinen Zellen. Das biologisch-immunreaktive Verhältnis des endogenen ACTHs lag bei diesen Proben bei 1:1,4, 1:3,1 und 1:2,6. Die Vermutung, dass das endogene ACTH während der Lagerung der Proben eventuell in biologisch aktive Substanzen zerfallen sein könnte, welche zur Stimulation der porcinen Zellen führen, konnte im Rahmen einer Stabilitätsstudie widerlegt werden. Demnach muß in Erwägung gezogen werden, dass der Bioassay mit porcinen Nebennierenrindenzellen für equine Blutproben nicht bedingungslos kompatibel ist. Durch diesen Bioassay lassen sich für die ACTH-stimulierte Cortisol-Ausschüttung der porcinen Zellen lediglich Tendenzen aufzeigen.
Entwicklung der klinischen ECS-Symptomatik
Bei an ECS erkrankten Pferden manifestieren sich trotz physiologischer oder sogar erniedrigter Cortisol-Plasmagehalte klinisch sichtbare ECS-Symptome. Demnach müssen noch andere biologisch aktive Substanzen, wie pro-OLMC-Peptide (a -MSH,
b -MSH, b -END, b -LPH, g -LPH, CLIP und g 3-MSH) oder ACTH-Fragmente, die qualitativ oder quantitativ verändert aus dem tumorösen Hypophysenzwischenlappen freigesetzt werden, an der Entwicklung der klinischen Symptomatik beteiligt sein.
Neben den endokrin bedingten klinischen Symptomen, könnte ein Teil der Symptomatik auch allein durch das Tumorwachstum verursacht werden. Durch die Expansion der Neoplasie wird Druck auf den Hypothalamus ausgeübt, wodurch kapilläre und neurale Verbindungen zwischen Hypothalamus und Hypophyse geschädigt werden und es so zu einer Entgleisung der hypothalamischen Funktionen kommt.
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